Control de la calidad y ensayos de rendimiento de CromoCen® SALM según la norma ISO 11133:2014/Amd. 1: 2018 / Quality control and performance testing of CromoCen® SALM according to ISO 11133: 2014 / Amd.1: 2018

Introducción: En Cuba, se desarrolló un medio de cultivo cromogénico y fluorogénico, para la detección, aislamiento y diferenciación de Salmonella de otras bacterias Gram negativas. El método que emplea el medio fue validado y su uso se adoptó en una norma cubana. El aseguramiento de la calidad y el control del rendimiento de los medios garantizan la confiabilidad de los resultados analíticos. La norma ISO 11133 establece criterios mínimos y métodos para evaluarlos. Objetivo: Evaluar los criterios de control de la calidad y de rendimiento de CromoCen® SALM, establecidos en la ISO 11133:2014/Amd.1:2018, para demostrar su fiabilidad para el análisis microbiológico de los alimentos de consumo humano. Métodos: Se evaluaron los indicadores de calidad físico-químicos de tres lotes y se definió un conjunto de ellos que caracteriza la calidad del medio antes y después de terminado, así como la consistencia entre lotes. Para el ensayo de rendimiento se seleccionaron 10 cepas de diferentes géneros. Se determinó la relación de productividad, el factor de selectividad y la electividad de CromoCen® SALM, según la ISO 11133. Resultados: La evaluación físico-química mostró una consistencia entre lotes en color, homogeneidad, apariencia del polvo y del medio preparado. Los valores de contenido de humedad y pH se encontraron dentro de los valores establecidos para este producto. La relación de productividad de CromoCen® SALM con respecto al agar triptona soya, fue superior al 50 por ciento, mientras que el factor de selectividad resultó de 4. Se demostró que en el medio de cultivo se puede diferenciar un grupo representativo de géneros microbianos de Salmonella. Conclusiones: CromoCen® SALM cumple con los requisitos de calidad establecidos para este tipo de productos, según la ISO 11133 vigente. La correcta formulación de los lotes, así como el cumplimiento de los requisitos de calidad aseguran el funcionamiento adecuado para lo que fue diseñado(AU)

Introduction: In Cuba, a new chromogenic and fluorogenic culture medium was developed for the detection, isolation and differentiation of Salmonella from other Gram negative bacteria. The method and medium were validated and their use was adopted as a Cuban standard. Quality assurance and control of media is essential and mandatory to ensure the reliability of the results of the analysis in which they are used. ISO 11133 establishes minimum criteria and methods to evaluate them. Objective: To evaluate the quality and performance criteria of CromoCen® SALM, as recommended in ISO 11133:2014/Amd.1:2018 to demonstrate its reliability for the microbiological analysis of food for human consumption. Methods: The physical-chemical quality indicators of three batches were evaluated and a group of them was defined to characterize its quality before and after finishing, as well to evaluate the consistency between batches. For the performance test, 12 strains of different genera were selected. The productivity ratio, the selectivity factor and the electivity of CromoCen® SALM were determined. Results: The physico-chemical evaluation showed a consistency between batches in color, homogeneity, appearance of the powder and of the prepared medium. The moisture content and pH values ranged within the established values for this product. The productivity ratio of CromoCen® SALM with respect to tryptone soy agar was greater than 50 percent, while the selectivity factor was 4. It was shown that in the culture medium a representative group of Salmonella microbial genera can be differentiated. Conclusions: CromoCen® SALM meets the quality requirements established for this type of products, according to the current ISO 11133 standard. The correct formulation of the batches, as well as the fulfillment of the quality requirements ensure the proper functionality and match the design purpose(AU)

Efecto de una combinación de nutrientes e inhibidores del crecimiento bacteriano sobre el desarrollo de Salmonella / Effect of a combination of nutrients and inhibitors of bacterial growth on the development of Salmonella

La selección de bases nutritivas para los medios de cultivo está relacionada con el microorganismo objeto de estudio y el propósito del medio. Los inhibidores del crecimiento bacteriano en los medios selectivos y diferenciales pueden interferir en el desarrollo del microorganismo de interés. Por ello se requiere un balance entre sustancias promotoras e inhibidoras del crecimiento bacteriano, sobre todo en bacterias que pueden encontrarse a muy bajas concentraciones o sometidas a diferentes condiciones de estrés durante el almacenamiento de las muestras que las contiene, como Salmonella. El objetivo consistió en evaluar el efecto de una combinación de nutrientes de diferentes orígenes y de inhibidores del crecimiento de bacterias grampositivas sobre el desarrollo de Salmonella. Se seleccionaron 52 cepas: incluyendo Salmonella, otras bacterias y levaduras. Se determinó la capacidad nutricional de mezclas de bases nutritivas registrando el incremento de la biomasa mediante técnica espectrofotométrica. Se comprobó la capacidad de recuperación e inhibición de dos variantes experimentales con diferentes inhibidores mediante la determinación de parámetros cuantitativos, y se comparó la productividad de la formulación final con un medio cromogénico. Salmonella mostró un crecimiento abundante en las variantes con diferentes combinaciones nutricionales, se logró la inhibición de un grupo de microorganismos y la productividad de la composición final fue superior a 0.80. La mezcla de bases nutritivas de diferentes orígenes y las sales biliares como inhibidor de crecimiento de bacterias grampositivas resulta una combinación eficaz para promover el crecimiento de Salmonella cuando estas bacterias se encuentran en baja concentración.

The selection of nutrient bases depends on the microorganism and the purpose of the medium. Inhibitors of bacterial growth are of great importance in selective and differential media and may interfere in the growth of the microorganism of interest. An adequate balance between promoter substances and inhibitors of bacterial growth is thus required, especially for bacteria that could be found either at very low concentrations or those subject to different stress conditions during storage of the samples containing them, such as Salmonella. The aim was to evaluate the effect of a combination of nutrients of different origins and inhibitors of grampositive bacteria on the development of Salmonella serotypes. 52 Salmonella strains and a representation of other bacteria and yeasts were selected. The nutritional capacity of the composition was determined by spectrophotometric technique formulating variants with mixtures of nutritive bases, and recording the increase in biomass. Recovery capacity and inhibition of two experimental variants with different inhibitors were quantitatively tested. The productivity of the final formulation was compared with a chromogenic medium (Oxoid, England). Salmonella showed abundant growth in the variants made with different nutrient combinations. Both experimental formulations showed their ability to recover microorganisms of interest. The final composition showed productivity values higher than 0.80 in both variants. The mixture of nutrient bases and bile salts as an inhibitor of growth of grampositive bacteria was an effective combination, capable of stimulating the growth of Salmonella genus when these bacteria are found at low concentration.

Estudio de estabilidad acelerado del diagnosticador HemoCen Aerobio / Accelerated stability study of the HemoCen Aerobic diagnostician

La bacteriemia es una complicación grave de las infecciones bacterianas. Un diagnóstico temprano del microorganismo responsable permite aplicar tratamientos efectivos en menor intervalo de tiempo. Los hemocultivos son diagnosticadores clínicos diseñado para este fin. Objetivo: Realizar un estudio de estabilidad acelerado de un lote del hemocultivo HemoCen Aerobio que permita planificar su diseño en estante en condiciones reales. Métodos: Se formuló un lote del hemocultivo HemoCen Aerobio en el Centro Nacional de Biopreparados, BioCen y se envasó asépticamente en los Laboratorios Biológicos Farmacéuticos, LABIOFAM. Se llevó a cabo un estudio de estabilidad acelerado por el Método de Arrenhius. Los frascos se conservaron durante 120 días a 15 °C, 30 °C y 50 °C. Se realizaron evaluaciones físico-químicas, organolépticas y capacidad de promoción de crecimiento de Staphylococcus aureus ATCC 25923 a los 7, 15, 30, 60 y 120 días. Resultados: El estudio de estabilidad demostró que el pH y el color del medio se deterioran progresivamente en el tiempo cuando las temperaturas aumentan entre 30 °C y 50 °C. La promoción de crecimiento de Staphylococcus aureus resultó favorable con índices de recuperación entre 20 y 40 UFC·frasco-1. Discusión: HemoCen Aerobio resulta funcional con un desempeño analítico satisfactorio, cuyos índices de recuperación microbiana se encuentran acorde a los valores reportados en bacteriemias de escasa magnitud. Estos resultados sientan las bases para planificar un estudio de estabilidad en estante en condiciones reales. Conclusión: Se estima un período de validez de 2 años(AU)

Bacteremia is a serious complication of bacterial infections. Early diagnosis of the causative organism allows applying appropriate treatments in a shorter time interval. Hemocultures are clinical diagnosticians designed for this purpose. Objective: Perform an accelerated stability study of a batch of HemoCen Aerobic hemoculture that allows planning its shelf designed in true conditions. Methods: A batch of HemoCen Aerobic hemoculture was formulated at the National Bioproducts Center, BioCen, and aseptically packaged at the Biological Pharmaceutical Laboratories, LABIOFAM. An accelerated stability study was carried out by the Arrenhius Method. The bottles were stored for 120 days at 15 °C, 30 °C and 50 °C. Physicochemical, organoleptic and growth promotion capacity evaluations of Staphylococcus aureus ATCC 25923 were realized at 7, 15, 30, 60 and 120 days. Results: The stability study demonstrated that the pH and the color of the medium progressively deteriorate over time as temperatures increase between 30 °C and 50 °C. Growth promotion of Staphylococcus aureus was favorable with recovery rates between 20 and 40 CFU bottle-1. Discussion: HemoCen Aerobic is functional with a satisfactory analytical performance, which recovery rates are consistent with the values reported in bacteremia of low magnitude. These results provide the basis for planning a shelf stability study under real conditions. Conclusion: A durability period of 2 years was estimated(AU)

Efecto de la combinación de bases nutritivas con el inhibidor sobre la recuperación de salmonelas / Effect of combining nutrient bases and inhibitor on recovery of Salmonella

INTRODUCCIÓN: las salmonelas son las causantes más frecuentes de enfermedades transmitidas por alimentos a nivel mundial. El caldo selenito cistina es un medio de enriquecimiento selectivo utilizado para la recuperación de especies de salmonelas en muestras de alimentos, aguas, heces y otros materiales de importancia sanitaria. OBJETIVO: evaluar la combinación de bases nutritivas obtenidas por métodos originales con el selenito de sodio para garantizar la adecuada recuperación de especies de salmonelas en el caldo selenito cistina. MÉTODOS: se realizó un estudio comparativo con diferentes bases nutritivas, que evaluó la promoción de crecimiento bacteriano de seis cepas de Salmonella y Shigella. Se prepararon dos variantes y se inocularon los microorganismos seleccionados a una concentración aproximada de 3 × 108 unidades formadoras de colonia por mililitro. El incremento de la biomasa se determinó a través de la medición de la absorbancia en un espectrofotómetro a 640 nanómetros cada una hora. Se comparó el comportamiento del medio caldo selenito cistina formulado por ingredientes con el caldo selenito cistina de Merck frente a los microorganismos de interés. Se determinó productividad y selectividad del medio de cultivo. RESULTADOS: la variante que contiene la mezcla de bases nutritivas (peptona bacteriológica Z, peptona de soya e hidrolizado enzimático de caseína) facilitó una mejor recuperación de las cepas ensayadas, mostró diferencias significativas (p< 0,05) con respecto a la variante que contiene solo hidrolizado enzimático de caseína. El medio experimental que contenía la mezcla de bases nutritivas con el selenito de sodio, mostró una recuperación de Salmonella a bajas concentraciones, similar al de referencia e inhibió mejor Escherichia coli a bajas concentraciones. A altas concentraciones ninguno de los dos medios pudo inhibir el crecimiento de E. coli. La productividad para ambos medios, resultó satisfactoria en el intervalo de 0,1 a 1, al igual que la selectividad con un valor aproximado de 3. CONCLUSIONES: la combinación de bases nutritivas originales con el selenito de sodio permitió una adecuada recuperación de las especies de salmonelas.

INTRODUCTION: Salmonella are the most common causes of food-borne disease worldwide. Selenite cystine broth is a selective enrichment medium used for the recovery of Salmonella species in samples of food, water, feces and other materials of clinical importance. OBJECTIVE: Evaluate the combination of nutrition bases obtained by original methods and sodium selenite to ensure appropriate recovery of Salmonella species in selenite cystine broth. METHODS: A comparative study was conducted with various nutrition bases to evaluate the fostering of bacterial growth in six strains of Salmonella and Shigella. Two variants were prepared and the microorganisms selected were inoculated at an approximate concentration of 3 × 108 colony-forming units per milliliter. Absorbance was measured with a 640 nanometer spectrophotometer every hour to determine biomass increase. Behavior of the selenite cystine broth medium formulated by ingredients was compared with that of Merck cystine selenite broth in the presence of the microorganisms of interest. Determination was performed of the productivity and selectivity of the culture medium. RESULTS: The variant containing the mixture of nutrient bases (bacteriological peptone Z, soybean peptone and casein enzymatic hydrolysate) facilitated better recovery of the strains tested, with significant differences (p< 0.05) with respect to the variant containing casein enzymatic hydrolysate alone. The experimental medium containing the mixture of nutrient bases and sodium selenite displayed Salmonella recovery at low concentrations in a manner similar to the reference medium and inhibited Escherichia coli more efficiently at low concentrations. At high concentrations neither medium was able to inhibit the growth of E. coli. Productivity was satisfactory in both media, ranging between 0.1 and 1, and so was selectivity, which reached an approximate value of 3. CONCLUSIONS: The combination of original nutrition bases and sodium selenite allowed appropriate recovery of Salmonella species.

Recuperación y diferenciación de aeromonas con CromoCen AE y CromoCen AGN / Recovery and differentiation of Aeromonas with CromoCen AE and CromoCen AGN

INTRODUCCIÓN: en la actualidad las especies del género Aeromonas han emergido como un problema de salud pública, son ellas los agentes etiológicos de las enfermedades diarreicas con el aumento de la atención médica por años. Los procedimientos convencionales para su diagnóstico son muy engorrosos, laboriosos y duraderos. Una nueva metodología que emplea medios de cultivo cromogénicos ha permitido la simplificación y aceleración de su diagnóstico, que ofrece resultados altamente específicos. OBJETIVO: estudiar el efecto de la combinación de diferentes agentes selectivos de los microorganismos grampositivos sobre el aumento de la capacidad de recuperación, cuantificación y diferenciación de las especies de Aeromonas. MÉTODOS: se estudió el efecto inhibidor de la combinación de agentes selectivos (desoxicolato de sodio (0,05-0,2 g·L-1), sales biliares (0,65 g·L-1), verde brillante (0,025-0,03 g·L-1), cristal violeta (0,001-0,01 g·L-1) y sulfito de sodio (0,8 g·L-1) sobre los microorganismos grampositivos, así como la capacidad de recuperación, cuantificación y diferenciación de las especies de Aeromonas. Como base se utilizó la formulación de CromoCen AGN, sin el desoxicolato de sodio. RESULTADOS: los valores de las productividades de los medios CromoCen AE y CromoCen AGN a partir del inóculo 1,5 × 102 UFC·mL-1 resultaron, para: A. hydrophila 116,8 % y 23,9 %, A. caviae 100,8 % y 3,95 %, A. bestiarium 93,6 % y 28,8 %, A. culicicola 85,1 % y 66,12 %, A. veronii 116,7 % y 59,2 %, A. popoffi 86,56 % y 13,2 %, A. trota 94,8 % y 11,25 % y para A. eucrinophila 103,9 % y 2,80 %. La nueva composición cromogénica logró la diferenciación de los microorganismos por sus características culturales: color, forma, superficie, bordes en las colonias y proteólisis del medio circundante. CONCLUSIONES: la combinación de diferentes agentes selectivos para la inhibición de los microorganismos grampositivos coadyuvo el aumento de la capacidad de recuperación, cuantificación y diferenciación de las especies de Aeromonas.

INTRODUCTION: Species of the genus Aeromonas are a current public health problem, for they are the etiological agents responsible for the growing incidence of diarrheal diseases requiring medical care. Conventional procedures for their diagnosis are very complicated, laborious and time-consuming. A new methodology based on the use of chromogenic culture media allows diagnostic simplification and acceleration, yielding highly specific results. OBJECTIVE: Study the effect of combining several selective agents for gram-positive microorganisms upon an increased capacity for recovery, quantification and differentiation of Aeromonas species. METHODS: Assessment was conducted of the inhibiting effect of combined selective agents (sodium deoxycholate (0.05-0.2 g·L-1), bile salts (0.65 g·L-1), brilliant green (0.025-0.03 g·L-1), crystal violet (0.001-0.01 g·L-1) and sodium sulfite (0.8 g·L-1)) on gram-positive microorganisms, as well as their capacity for recovery, quantification and differentiation of Aeromonas species. The base used was the CromoGen AGN formulation without sodium deoxycholate. RESULTS: Productivity values for the media CromoCen AE and CromoCen AGN based on inoculation of 1.5 × 102 CFU·mL-1 were 116.8 % and 23.9 % for A. hydrophila, 100.8 % and 3.95 % for A. caviae, 93.6 % and 28.8 % for A. bestiarium, 85.1 % and 66.12 % for A. culicicola, 116.7 % and 59.2 % for A. veronii, 86.56 % and 13.2 % for A. popoffi, 94.8 % and 11.25 % for A. trota, and 103.9 % and 2.8 0% for A. eucrinophila. The new chromogenic composition enabled differentiation of microorganisms based on their cultural characteristics: color, shape, surface, colony borders and environmental proteolysis. CONCLUSIONS: Combination of various selective agents for the inhibition of grampositive microorganisms led to an increased capacity for recovery, quantification and differentiation of Aeromonas species.

Efecto de una combinación nutritiva y selectiva con sustratos cromogénicos para diagnóstico de cocos grampositivos / Effect of a selective nutrient combination of chromogenic substrates for diagnosis of Grampositive cocci

INTRODUCCIÓN: la reemergencia de infecciones por bacterias grampositivas y el aumento de su patogenicidad, requiere de un diagnóstico microbiológico rápido y certero. En BioCen se desarrolló una composición cromogénica para el aislamiento, cultivo y diferenciación rápida y presuntiva de microorganismos grampositivos por medio de reacciones cromogénicas específicas, donde las bacterias gramnegativas se encuentran inhibidas de manera parcial o total. OBJETIVO: evaluar el efecto de la combinación de bases nutritivas, inhibidores selectivos y sustratos cromogénicos para aumentar la selectivad y capacidad diferencial para especies de los géneros Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus de importancia clínica. MÉTODOS: se evaluaron 21 cepas microbianas de la American Type Culture Collection y 24 aislamientos clínicos de Streptococcus, Enterococcus y Staphylococcus y otros microorganismos gramnegativos. Se evaluaron diferentes combinaciones de bases nutritivas, acetato de talio, ácido nalidíxico y sustratos cromogénicos para la promoción del crecimiento y diferenciación de las bacterias grampositivas. Se evaluó la funcionalidad microbiológica y se le determinaron los parámetros de calidad diagnóstica. RESULTADOS: la combinación de bases nutritivas permitió el desarrollo de los microorganismos grampositivos, en 24 h y su diferenciación por reacciones cromogénicas específicas. El crecimiento de los microorganismos gramnegativos fue inhibido por la acción del acetato de talio (0,014 g·L-1) y ácido nalidíxico (0,008 g·L-1), excepto Proteus mirabilis y Pseudomonas aeruginosa, cuyas características morfológicas no interfieren en la diferenciación de los microorganismos diana. La sensibilidad, especificidad y exactitud diagnósticas fueron del 100 %. CONCLUSIÓN: la combinación de las bases nutritivas, los inhibidores selectivos y los sustratos cromogénicos permitió el desarrollo y diferenciación de especies de los microorganismos evaluados. La inoculación en el medio cromogénico de microorganismos diana y no diana y la diferenciación de aquellas cepas donde se detectó color similar de las colonias por medio de pruebas complementarias rápidas, le confirió al medio elevadas sensibilidad, especificidad y exactitud diagnóstica.

INTRODUCTION: reemergence of Grampositive bacteria infections and the rise of their pathogenicity require a quick and accurate microbiological diagnosis. BioCen has developed a chromogenic composition for isolation, culturing and rapid and presumptive differentiation of gram-positive microorganisms through specific chromogenic reactions in which the inhibition of gramnegative bacteria is partial or total. OBJECTIVE: to evaluate the effect of a combination of nutrient bases, selective inhibitors and chromogenic substrates to increase the selectivity and differential capacity to detect Enterococcus, Streptococcus and Staphylococcus species of clinical importance. METHODS: twenty one microbial strains from the American Type Culture Collection and 24 clinical isolates of Enterococcus, Streptococcus and Staphylococcus and of other gramnegative microorganisms were evaluated. Various combinations of nutrient bases, thallium acetate, nalidixic acid and chromogenic substrates were also assessed for the promotion, growth and differentiation of grampositive bacteria. The microbiological functionality was evaluated whereas the diagnostic quality parameters were determined. RESULTS: the combination of nutrient bases allowed the development of grampositive microorganisms in 24 hours and their differentiation through specific chromogenic reactions. The growth of gramnegative microorganisms was inhibited by the thallium acetate (0.014 g·L-1) and nalidixic acid (0,008 g·L-1) except for Proteus mirabilis and Pseudomonas aeruginosa whose morphological characteristics do not interfere with differentiation of target microorganisms. Sensitivity, specificity and accuracy for diagnosis were 100 %. CONCLUSIONS: the combination of nutrient bases, selective inhibitors and chromogenic substrates allowed the development and differentiation of the evaluated microorganism species. The inoculation of target and non-target microorganisms in the chromogenic medium and the differentiation of those strains where a similar color of the colonies was detected by means of supplementary rapid tests provided the medium with high diagnostic sensitivity, specificity and accuracy.

Peptona papaínica de corazón de vaca como fuente de nutrientes para los microorganismos / Beef heart papainic peptone as a source of nutrients for microorganisms

La peptona papaínica del músculo de corazón de res puede ser utilizada como componente fundamental de las combinaciones nutritivas para el cultivo de una gran variedad de microorganismos...

Combinaciones de bases nutritivas empleadas en el desarrollo del medio caldo nitrato / Nutritional bases combinations used in the development of nitrate broth medium

INTRODUCCIÓN: el medio caldo Nitrato es utilizado en los laboratorios de microbiología clínica como prueba bioquímica para la identificación de enterobacterias por la capacidad que tienen estos microorganismos para reducir los nitratos a nitrito. OBJETIVO: evaluar diferentes combinaciones de bases nutritivas destinadas al desarrollo del medio de cultivo. MÉTODOS: se seleccionó como material biológico un conjunto de cepas certificadas y aisladas pertenecientes a especies representativas de varios géneros de la familia de Enterobacteriaeceae. Se diseñaron cinco variantes y se utilizó como bases nutritivas la peptona de gelatina y el extracto de carne, en diferentes combinaciones y concentraciones, para determinar el incremento de absorbancia en el tiempo como indicador de la densidad microbiana y se calculó la velocidad de crecimiento. Se evaluó la capacidad funcional del medio de cultivo por la habilidad de las especies de reducir o no el nitrato a nitrito. RESULTADOS: la mejor combinación de bases nutritivas correspondió a la de mayor concentración de peptona de gelatina (10 g/L) y extracto de carne (3 g/L). La evaluación organoléptica y fisicoquímica del medio de cultivo mostró características satisfactorias para este tipo de producto. Se comprobó la reducción satisfactoria del nitrato a nitrito, por los microorganismos empleados como control positivo. CONCLUSIONES: el medio de cultivo caldo nitrato desarrollado, cumple con los requisitos de calidad y su funcionalidad microbiológica y permite la caracterización de especies bacterianas que poseen la capacidad de reducir los nitratos a nitritos.

INTRODUCTION: the nitrate broth culture medium is used in clinical microbiology laboratories as a biochemical test for the identification of Enterobacteriaceae by the ability of these microorganisms to reduce nitrate to nitrite. OBJECTIVE: to evaluate different combinations of nutritive bases for the development of the culture medium. METHODS: certificed strains were selected as biological test material. The strains belong to different generu of the Enterobactericiae family. Five variants were designed with gelatin peptone and meat extract as nutrient bases at different concentrations and combinations, the growth rate was calculated by measuring the increase in absorbance over time as an indicator of microbial density. The functionality of the culture medium was evaluated by the ability of tested bacteria or reduce nitrate to nitrite RESULTS: the best combination of nutritive bases contained the highest concentration of gelatin peptone (10 g/L) and beef extract (3 g/L). Physicochemical and sensory evaluation of the culture medium showed results characteristic for this type of product. Reductions of nitrate to nitrite were observed for all tested microorganisms choosed as the positive control. CONCLUSIONS: the nitrate broth culture medium developed complies the quality requiment and its microbiological functionality allows the characterization of bacterial species by the ir ability to reduce nitrate to nitrite

Determinación cuantitativa de enterococos en aguas utilizando un método cromogénico alternativo / Quantitative determination of enterococci in water using an alternative chromogenic method

INTRODUCCIÓN: el control de la calidad de las aguas es vital para la protección de la salud humana y la biodiversidad en el ambiente acuático. Varios microorganismos son utilizados como indicadores de contaminación fecal para este propósito, dentro de ellos los enterococos son considerados buenos indicadores, porque sobreviven más tiempo ante condiciones adversas en la naturaleza. OBJETIVOS: evaluar la capacidad de un nuevo método cromogénico alternativo para la detección y enumeración de enterococos en aguas por la técnica de filtración por membrana, en comparación con el método estándar ISO 7899:2. MÉTODOS: se recolectaron muestras de aguas de tres orígenes diferentes para determinar su calidad. Las muestras se ensayaron en paralelo por las dos metodologías (alternativa y referencia), empleando la técnica de filtración por membrana. Para evaluar el desempeño de los métodos se determinaron varios parámetros: sensibilidad, especificidad, exactitud, porcentaje de falsos positivos, porcentaje de falsos negativos, índice kappa. Los tres primeros parámetros se calcularon para ambos métodos antes y después de la confirmación por pruebas bioquímicas. Los resultados se analizaron desde el punto de vista estadístico, teniendo en cuenta los principales criterios definidos en las normas ISO 16140 e ISO 177994. RESULTADOS: con el método alternativo los resultados se obtuvieron a las 24 h, estos mostraron valores de sensibilidad (99 %) y exactitud (98 %) más elevados que con el de referencia (97 % y 97 %, respectivamente), el cual demoró más de 48 h. La eficiencia y exactitud de ambos métodos fue similar y se obtuvo una concordancia entre ellos casi perfecta (kappa = 0,96) con el total de las muestras de aguas ensayadas. CONCLUSIONES: los resultados alcanzados indican que el método alternativo es eficiente para el recuento de enterococos provenientes de diferentes tipos de muestras de agua. Resulta además un método simple, más rápido y económicamente factible.

INTRODUCTION: water quality control is essential for the protection of human health and biodiversity in the aquatic environment. For this purpose, several microorganisms are used as indicators of fecal contamination. Among them are enterococci, which are considered to be good indicators, since they survive for a longer time in adverse natural conditions. OBJECTIVES: evaluate the suitability of a new alternative chromogenic method for the detection and enumeration of enterococci in water by membrane filtration technique, in comparison with the ISO 7899:2 standard method. METHODS: water samples were collected from three different sources to determine their quality. The samples were assayed in parallel with the two methodologies (alternative and reference) using the membrane filtration technique. The following parameters were determined to evaluate the performance of the methods: sensitivity, specificity, accuracy, percentage of false positives, percentage of false negatives, kappa index. The first three parameters were estimated for both methods before and after confirmation by biochemical testing. Results were analyzed statistically based on the main criteria defined by ISO standards 16140 and 177994. RESULTS: with the alternative method, results were obtained at 24 h, whereas the reference method required more than 48 h. Sensitivity and accuracy were higher with the alternative method (99 % and 98 %, respectively) than with the reference method (97% and 97%, respectively). Both methods had similar efficiency and accuracy, with almost perfect concordance between them (kappa = 0.96) in all the water samples tested. CONCLUSIONS: results show that the alternative method is efficient for the enumeration of enterococci from different types of water samples. It is also a simple, faster and economically feasible method.

Evaluación de la peptona papaínica de corazón de res para el enriquecimiento selectivo de Enterococcus / Evaluation of beef heart papainic peptone for selective enrichment of Enterococcus

Introducción: el control microbiológico de aguas y alimentos ha motivado el desarrollo de medios de cultivo selectivos capaces de detectar Enterococcus, los cuales necesitan de una fuente de energía apropiada para garantizar la recuperación de estos. Objetivos: comparar diferentes bases nutritivas elaboradas a partir de productos y subproductos alimenticios según su capacidad de promoción de crecimiento del género Enterococcus y evaluar la exactitud del medio de cultivo caldo azida dextrosa. Métodos: para el ensayo se seleccionaron 80 cepas de diferentes géneros. Se prepararon dos variantes experimentales del caldo azida dextrosa (una tamponada) y se inocularon los microorganismos seleccionados a una concentración estandarizada. El incremento de la biomasa se determinó midiendo la densidad óptica en un espectrofotómetro a 640 nm cada una hora. La evaluación microbiológica del medio de cultivo se realizó utilizando diferentes géneros microbianos a distintas concentraciones. Se determinó la sensibilidad, especificidad, exactitud diagnóstica y relativa y el índice Kappa del diagnosticador. Como medio de referencia se utilizó el caldo azida glucosa proveniente de la firma comercial Merck (Alemania). ..

Introduction: microbiological control of water and food has motivated the development of selective culture media capable of detecting Enterococcus, which need an appropriate source of energy to ensure the recovery of microorganisms. Objectives: compare different nutrient bases produced from food products and by-products according to their growth promotion capacity for the genus Enterococcus, and evaluate the accuracy of dextrose azide broth culture medium. Methods: eighty strains of different genera were selected for the test. Two experimental variants of dextrose azide broth were prepared (one buffered) and the microorganisms selected were inoculated at a standardized concentration. Biomass increase was determined by measuring optical density in a spectrophotometer at 640 nm every 1 h. Microbiological evaluation of the culture medium was carried out using different microbial genera at different concentrations. Diagnostic and relative sensitivity, specificity and accuracy, and the Kappa index were determined for the culture medium. Glucose azide broth (Merck, Germany)ss production than the other genera...

Enterococcus, medios de cultivo convencionales y cromogénicos / Enterococcus, conventional and chromogenic culture media

El género Enterococcus ha sufrido variaciones en su clasificación y es considerado actualmente como un género independiente de Streptococcus. Por su elevada incidencia en las infecciones nosocomiales y su resistencia antimicrobiana, y por ser considerados indicadores de contaminación fecal, estos microorganismos han adquirido una importancia notable en la actualidad y se ha desarrollado una gran cantidad de medios de cultivo de diferentes propósitos, tanto convencionales como cromogénicos y/o fluorogénicos, específicos para este género, que son empleados en los laboratorios de Microbiología de todo el mundo para lograr su aislamiento e identificación de muestras clínicas, aguas y algunos alimentos. La selección del tipo de medio a utilizar depende de la experiencia, así como también del tipo de muestra, del método de cultivo y del grado de contaminación de la muestra con otros organismos, por lo que resulta de gran importancia realizar una revisión bibliográfica sobre esta temática. El objetivo de esta revisión bibliográfica sobre el tema consiste en realizar una recopilación de los principales medios de cultivo existentes para este género, su principio de funcionamiento, así como los principales ingredientes que contienen, y resaltar las ventajas que tiene el uso de los medios cromogénicos y/o fluorogénicos al ser mucho más sensibles, rápidos y exactos

The genus Enterococcus has been classified in different manners. At present, it is considered to be a separate type of Streptococcus. These microorganisms have gained considerable importance due to their high incidence in nosocomial infections, their antimicrobial resistance and their role as indicators of fecal contamination. A large number of culture media have been developed for different purposes related to this genus. These include conventional, as well as chromogenic and/or fluorogenic culture media, used in microbiology laboratories around the world for isolation and identification in clinical samples, water and some food products. Choice of a given medium is based on experience, sample type, culture method and degree of sample contamination with other organisms. Hence the importance of carrying out a bibliographic review of the subject. The purpose of this second bibliographic review was to collect information on the main culture media used for this genus, their operating principle and their main ingredients, highlighting the advantages of chromogenic and/or fluorogenic media, due to their greater speed, sensitivity and accuracy

Validación de métodos alternativos para análisis microbiológico de alimentos y aguas / Validation of alternative methods for the microbiological analysis of food products and water

El empleo de métodos microbiológicos alternativos para la detección de microorganismos es una herramienta importante para garantizar la inocuidad de alimentos y aguas. Numerosos y diversos métodos alternativos para microbiología se comercializan actualmente gracias a avances recientes, sobre todo en el campo de la biotecnología. Para que un nuevo método microbiológico sea aceptado, su fabricante debe demostrar su adecuación. En una primera revisión, se realizó el análisis de los principales parámetros determinados en la validación de los métodos microbiológicos cualitativos. El objetivo de esta segunda parte consiste en abordar los indicadores más importantes a considerar para los métodos microbiológicos cuantitativos

The use of alternative microbiological methods for the detection of microorganisms is an important tool to ensure the safety of food products and water. A large number of alternative microbiological methods are currently available on the market, thanks to recent advances mainly in the field of biotechnology. In order for a new microbiological method to be accepted, its manufacturer must prove its adequacy. In a first review, an analysis was made of the main parameters determined for the validation of qualitative microbiological methods. The purpose of this second part is to approach the most important indicators to be considered for quantitative microbiological methods

Evaluación del medio cromogénico CromoCen® ENT para el diagnóstico clínico de Enterococcus / Assessment of the CromoCen ENT® chromogenic medium for clinical diagnosis of Enterococcus species

Introducción: la frecuente incidencia de Enterococcus en los hospitales y su creciente resistencia antimicrobiana a nivel mundial, ha incrementado la necesidad de su vigilancia y control intrahospitalario, por lo que resulta imprescindible contar con medios diagnósticos más sensibles y exactos. Objetivo: ampliar la evaluación de la funcionalidad del medio cromogénico CromoCen® ENT para el aislamiento e identificación de Enterococcus spp. procedentes de muestras clínicas. Métodos: se analizaron 150 muestras clínicas (orina, sangre, fecales, exudados vaginales, exudados de lesiones de piel y de catéteres) desde enero hasta abril de 2010, empleando el medio cromogénico y los medios convencionales correspondientes como controles, se evaluó la incidencia de Enterococcus spp. Se identificaron los aislamientos con un conjunto de 12 pruebas bioquímicas. A partir de los datos de la identificación bioquímica se determinaron los indicadores de calidad tanto para el medio CromoCen® ENT como para los medios de referencia. Resultados: el medio cromogénico promovió el crecimiento de Enterococcus spp. en solo 24 h, lo cual permitió su fácil reconocimiento por la coloración rosada de las colonias. Los indicadores de calidad diagnóstico mostraron valores superiores a 95 %. El mayor porcentaje de aislamientos se obtuvo en las muestras de orina. Enterococcus faecalis resultó la especie mayormente encontrada en el total de las muestras. Conclusiones: CromoCen® ENT permitió la correcta y rápida identificación de Enterococcus spp. procedentes de diversas muestras clínicas.

Introduction: the frequent incidence of Enterococci at hospitals and their growing antimicrobial resistance worldwide make the in-hospital surveillance and control a pressing need; consequently, it is indispensable to avail of more sensitive and accurate diagnostic means. Objective: to broaden the evaluation of functionality of CromoCen® ENT chromogenic medium for the isolation and identification of Enterococcus spp. from clinical samples. Methods: one hundred and fifty clinical samples were analyzed (urine, blood, feces, vaginal smears, skin lesion exudates and exudates from catheters) in the January-April period, 2010 by using the chromogenic medium and the corresponding conventional culture media as controls; the incidence of Enterococcus spp was evaluated. The isolations were identified with 12 biochemical tests. From the biochemical identification data, it was possible to determine the quality indicators for both CromoCen® ENT and the reference media. Results: the chromogenic medium encouraged the growth of Enterococcus species in 24 hours, allowing their easy recognition due to the pink coloration of the colonies. The diagnostic quality indicator values were over 95 %. The highest percentage of isolates was observed in the urine samples. Enterococcus faecalis was the mostly found species. Conclusions: CromoCen® ENT allowed quick and accurate identification of Enterococcus spp. from various clinical samples.

Aspectos fundamentales sobre el género Enterococcus como patógeno de elevada importancia en la actualidad / Fundamental features on he Enterococcus genus as a very important pathogen at present time

En los últimos años el género Enterococcus ha cobrado una gran importancia al nivel internacional por su elevada incidencia en las enfermedades nosocomiales y por la adquisición de resistencia a muchos antimicrobianos. De igual manera, son considerados indicadores de la inocuidad de los alimentos, pues debido a su amplia distribución, pueden encontrarse en estos productos y sobrevivir a los procesos de tratamiento a que son sometidos, por su elevada resistencia a condiciones adversas. Igualmente, se encuentran dentro del grupo de microorganismos indicadores de contaminación fecal de las aguas, y se consideran como el indicador más eficiente para evaluar la calidad del agua de mar para uso recreativo. Aunque en Cuba existen algunos reportes de aislamientos de estos microorganismos en la clínica, el diagnóstico en este sentido aún es insuficiente, también es escasa o nula la búsqueda de estos microorganismos en aguas y alimentos, por lo que resulta imprescindible realizar una revisión bibliográfica sobre esta temática. El objetivo de esta primera revisión consiste en profundizar en los aspectos fundamentales sobre el género Enterococcus.

In the last years Enterococcus genus has gained in relevance due to its high incidence in nosocomials illnesses and resistance acquisition to many antimicrobials agents. These microorganisms are considered indicators of the food inocuit due to their wide distribution, their presence in products and their ability to survive different processes and their high resistance to adverse conditions. Simillary, they are considered as indicators microorganisms of fecal contamination of water, being considered as the most efficient parameter to evaluate the quality of recreational seewater. Although in Cuba exist some reports about the isolations of these microorganisms in the clinic, the diagnosis is still insufficient. Also is poor or null the search of these microorganisms in waters and foods, therefore it is indispensable to carry out a review on this matter. The objective of this first revision consists on approaching the more fundamental aspects related with Enterococcus genus.

Validación de métodos alternativos para análisis microbiológico de alimentos y aguas. cualitativos / Validation of alternative methods for microbiological analysis of foods and water. Qualitative methods

Internacionalmente han aumentado las exigencias para la adopción de nuevos métodos microbiológicos para el análisis de aguas y alimentos. Estos son adoptados cuando ofrecen rapidez, menor laboriosidad, son más sencillos, entre otras ventajas. Para lograr este objetivo, es necesario demostrar su fiabilidad y la equivalencia en relación con los métodos tradicionales existentes. En Cuba esta temática es relativamente incipiente, por lo tanto, resulta oportuno realizar una revisión bibliográfica sobre esta materia. El objetivo de esta primera revisión consiste en abordar los parámetros más significativos relacionados con la validación de métodos microbiológicos cualitativos alternativos.

Internationally the demands for the adoption of new microbiological methods for the analysis of waters and foods have increased. These are adopted when they are high-speed, less laborious, more easy, among other advantages. To achieve this objective, it is necessary to demonstrate their reliability and the equivalence according to the existent traditional methods. In Cuba this topic is relatively incipient, therefore it is appropriate to carry out a review on this matter. The objective of this first revision consists on approaching the more significant parameters related with the validation of alternative qualitative microbiological methods.

Identificación de especies de Candida de importancia clínica con un método auxonograma modificado / Identification of Candida species of clinical importance by means of a modified auxonographic method

INTRODUCCIÓN: las especies de Candida son responsables de la mayoría de las infecciones micóticas oportunistas. La identificación rápida y precisa de las levaduras es importante no solo para la aplicación del tratamiento efectivo de la infecciones, sino para prevenir la emergencia de cepas con resistencia a las drogas. Hasta ahora, los procedimientos para su identificación se basan en varias pruebas, incluida la habilidad de asimilar azúcares como única fuente nutricional. OBJETIVO: el propósito del presente estudio fue evaluar una modificación de la prueba de auxonograma de sustancias carbonadas, utilizada para la identificación de especies de Candida en un período de 24 a 48 h. MÉTODOS: el procedimiento, basado en la asimilación de sustancias carbonadas (auxonograma), fue evaluado para la identificación de las especies de Candida de mayor relevancia clínica. Un total de 164 cepas del género Candida fueron incluidas en el estudio, de ellas 156 aisladas a partir de muestras clínicas y otras 8 cepas de referencia provenientes del cepario central de BioCen (C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei y C. kefyr). En el procedimiento se utilizó una suspensión estandarizada de levadura, que se inoculó por el método de vertimiento en placa en un medio libre de carbono, esterilizado en autoclave. Sobre la mezcla (60 mL de medio de cultivo y 3 mL de suspensión microbiana) solidificada se dispensaron 10 µL de varias soluciones de carbohidratos esterilizadas por filtración en diferentes puntos del medio de cultivo. La asimilación del compuesto fue observada como una zona de crecimiento alrededor del punto de distribución del carbohidrato después de 24 a 48 h de incubación. RESULTADOS: todas las especies de Candida fueron correctamente identificadas por el método de auxonograma modificado y se logró 100 por ciento de concordancia con la técnica de Wickerham. CONCLUSIONES: el método alternativo para la prueba de auxonograma del carbono es simple, confiable, más rápido y más fácil de interpretar que el de Wickerham.

INTRODUCTION: Candida species are responsible for the most common opportunistic mycotic infections. Rapid and accurate identification of yeast has become relevant not only for the effective management of infections, but also for the prevention of drug resistance. Up to now, yeast identification procedures are based on a variety of tests, including their ability to use sugars. OBJECTIVE: the purpose of the study was to evaluate a modified auxonographic procedure with the use of carbonated compounds for the rapid identification of Candida species within 24 to 48 h. METHODS: the new procedure is based on the carbohydrates assimilation (auxonograph) and was developed and evaluated for the identification of the most clinically relevant Candida species. A total number of 164 Candida species strains were included in the study, 156 of them were isolated from clinical specimens and other 8 reference strains from the central culture collection of BioCen (C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei y C. kefyr). The new methodology was based on the use of standardized yeast suspension of carbon-free culture medium sterilized by autoclaving. After gelling the mixture (60 mL of cultural medium and 3 mL of microbial suspension), 10 µL of different carbohydrate filtering-sterilized solutions were dispensed at different points of the culture medium surface. The carbohydrate uptake was seen as a growth zone around the carbohydrate point of distribution after 24-48 h of incubation. RESULTS: all Candida species were correctly identified by the modified auxonographic method and 100 percent agreement with the Wickerham technique was achieved. CONCLUSIONS: the alternative method for the auxonographic carbon test is simple, reliable, faster and easier to interpret than the Wickerham method.

Caracterización de un hidrolizado ácido de caseína / Characterization of a casein acid hydrolysate

INTRODUCCIÓN: la mayor disponibilidad de caseína seca en polvo en el mercado y la escasa oferta de caseína húmeda, ocasionaron la factibilidad de modificar el proceso tecnológico de obtención del hidrolizado ácido de caseína. OBJETIVO: caracterización del hidrolizado ácido de caseína obtenido a escala industrial por una nueva tecnología en el Centro Nacional de Biopreparados (Cuba) y su desempeño en los medios de cultivo. MÉTODOS: se evaluaron 10 lotes del producto, a los cuales se les realizó el análisis químico, así como la evaluación del desempeño mediante la determinación de la densidad microbiana en el tiempo y la realización de las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. RESULTADOS: se demostró que el hidrolizado posee valores de los principales componentes químicos característicos de los productos que se comercializan en el mercado internacional: nitrógeno amínico 6,59 ± 0,71 por ciento, nitrógeno total 8,12 ± 0,41 por ciento y composición aminoacídica. Como características distintivas el producto muestra un contenido reducido de cloruro de sodio (32,63 ± 2,46 por ciento), calcio (334 mg/L), magnesio (133 mg/L) y pérdida por desecación (3,34 ± 0,66 por ciento). La capacidad de promoción de crecimiento de Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 no mostraron diferencia significativa con respecto a hidrolizados proteicos de otros proveedores: Biotécnica International, Merck y Oxoid Ltd. (p< 0,05). Se alcanzó un crecimiento bacteriano en el caldo Mueller Hinton a altas diluciones (10-6). Los valores de susceptibilidad de diferentes microorganismos a los antibióticos en el medio agar Mueller Hinton concordaron en relación con los establecidos en las normas del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). CONCLUSIÓN: el producto obtenido puede ser empleado como componente de medios de cultivo con diferentes requerimientos y con adecuada estabilidad.

INTRODUCTION: the great availability of dry powdered casein in the market and low accessibility of wet casein induced the viability of modifying the technological process for obtaining casein acid hydrolysate. OBJECTIVES: to characterize the casein acid hydrolysate obtained at industrial scale by a new technology in the National Center of Biological Products of Cuba and to test its performance in culture media. METHODS: ten product batches were tested by chemical composition analysis, and their performance was evaluated through measuring the microbial density vs time and conducting susceptibility antimicrobial tests. RESULTS: it was demonstrated that the hydrolysate had values of the main chemical components inherent to the products in the international market such as amino nitrogen 6,59 ± 0,71 percent, total nitrogen 8,12 ± 0,41 percent and aminoacid composition. As distinctive characteristics, the product shows reduced contents of some components like: sodium chloride (32,63 ± 2,46 percent), calcium (334 mg/L), magnesium (133 mg/L) and loss on drying (3,34 ± 0,66 percent). The growth encouraging capacity for Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 did not show significant differences with protein hydrolysates from other commercial sources, namely Biotecnica International, Merck and Oxoid Ltd. (p<0,05). It appeared bacterial growth in Mueller Hinton´s broth at high dilutions (10-6). The antimicrobial susceptibility values in the Mueller Hinton Agar agreed with those established by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). CONCLUSIONS: the product may be used as a component of culture media with different requirements and adequate stability.

Bases nutritivas para el cultivo de los microorganismos: parte 2 - principales indicadores de la calidad / Nutritive bases for the culture of microorganisms: Part 2 - main quality characteristics

Las bases nutritivas empleadas para el cultivo microbiano deben reunir una serie de características esenciales como aportantes de nutrientes, en especial, de componentes nitrogenados de origen proteico, tales como aminoácidos, péptidos y polipéptidos; macroelementos y microelementos, así como vitaminas y carbohidratos. Otro grupo de indicadores comprende características fisicoquímicas como pH, densidad aparente, propiedades organolépticas (color) y tecnológicas (rendimiento). Los índices biológicos y sanitarios son fundamentales para su funcionalidad en los medios, entre ellos, la reactividad biológica, que incluye la producción de indol, acetilmetilcarbinol y gas sulfhídrico y presencia de carbohidratos fermentables; el límite microbiano y la promoción del crecimiento de microorganismos específicos.

Nutritive bases for microbial growth, as nutrient sources, should comply with a group of essential characteristics, especially as sources of nitrogenous compounds derivedfrom proteins, such as aminoacids, peptides andpolypeptides, as well as sources of vitamins andcarbohydrates. Other group of characteristics includesphysico-chemical parameters such as pH, apparentdensity, organoleptic (color) and technological (yield)properties. Biological and sanitary characteristics are fundamentalfor their funcionality in culture media, amongthem, the biological reactivity that includes indole, acethylmethylcarbinol and hydrogen sulphide productionand the presence of fermentable carbohydrates, microbiallimit and the growth promotion of specific microorganisms.

Bases nutritivas para el cultivo de los microorganismos: parte 1 - Procesos tecnológicos / Nutritive bases for the culture of microorganisms: part 1 - Technological processes

Los medios de cultivo pueden ser definidos como conjuntos de elementos o sustancias que garantizan a los microorganismos u otras células los nutrientes necesarios para su conservación o desarrollo. Las bases nutritivas son ingredientes fundamentales de muchos de estos medios y aportan, para el crecimiento de los microorganismos, los compuestos nitrogenados de naturaleza proteica, tales como péptidos, polipéptidos, aminoácidos, vitaminas, carbohidratos y otros elementos nutritivos. Se obtienen mediante extracción o hidrólisis del material biológico, por diferentes vías, seguido de clarificación mediante la filtración, concentración, secado y tamizado. Especial interés ocupa la búsqueda de diferentes sustratos proteicos alternativos, debido al incremento de la frecuencia de los brotes de encefalopatía espongiforme bovina y fiebre aftosa en diferentes países, el peligro de transmisión de estas enfermedades al hombre a través de las proteínas derivadas de los sub productos de los animales y las regulaciones para el comercio, importación y uso de estos productos.

Culture media could be defined as a group of elements or substances, which provide, to microorganisms or toother cells, the necessary nutrients for their preservation or growth. Nutritive bases are main ingredients for muchof these media and they provide for the growth of microorganisms, protein derived nitrogen compoundssuch as peptides, polypeptides, aminoacids; vitamins, carbohydrates and other nutritive elements. They areobtained by extraction or hydrolysis of biological rawmaterial by different ways, and then undergo processesof clarification, filtration, concentration, drying andsieving. It is of great interest to identify different alternative protein substrates, due to the increase of Bovine Spongiform Encephalopathy and Aftose Feveroutbreaks in different countries, the possible spread ofthese diseases to humans by proteins derived from animalby-products and due to trading, importation and consumption regulations for these products.